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百合无病毒种球(鳞茎)规模化生产技术
来源:网络投稿 日期:2016-07-09 12:00

百合花


(1)无病毒种球繁殖目前已发现约有15种以上的病毒可感染百合,但百合最易受其中6种主要病毒的危害,这6种病毒是黄瓜花叶病毒(CMV)、百合无症病毒(LSV)、郁金香碎花病毒(TBV)、百合斑驳病毒(LMoV)、百合X病毒(LXV)、百合丛簇病毒(LRV),尤以百合无症病毒发生最为普遍,可高达70%~80%。病毒的传播速度非常快,对百合切花的品质有很大影响,因此需要通过茎尖培养、热处理、化学疗法等方法脱除病毒。茎尖离体培养技术详见下文。化学疗法和热处理法是将感染病毒的百合鳞片接种到含病毒唑或二硫脲嘧啶的培养基上,随培养时间的延长,病毒浓度降低,约40%的再生小鳞茎可脱除病毒。如果鳞片接种后,放在35℃高温下保持4周,脱毒效果比单独使用化学疗法效果好。百合鳞片离体培养中加入抗病毒抑制剂DHT,也可去除黄瓜花叶病毒和百合无症病毒,并且对芽的分化影响小。

1)茎尖培养脱毒赵祥云等研究利用百合植株的茎尖或珠芽生长点等外植体,接种到MS加激素的培养基上,可直接诱导出无病毒种苗。

a.无菌体系建立 在经过低温处理打破休眠的鳞茎中,选择生长健壮、无病虫害的百合鳞茎做外植体,用洗涤灵清洗干净,将其外部鳞片剥去,只留最里层两三个鳞片。将剥好的小球在超净工作台上用酒精消毒30s,再用0.1%升汞液消毒5min,再用无菌水冲洗4~6遍,用无菌滤纸吸干水分。

将已消毒的外植体外层的鳞片剥去,露出生长点,将带有1~2个叶原基的生长点在解剖镜下用手术刀切成0.1~0.2mm的薄片1~3片,将切下的薄片分别编号,按顺序接种到MS+6-BA

0.5mg/L+2,4-D0.25mg/L的培养基上,能顺利诱导出愈伤组织。培养基的pH值5.8~5.9,培养温度25~28℃,光照20001x。培养1周左右时会有个别污染出现,但污染率很低,一般在5%左右。其原因多由操作引起,而由消毒引起的污染几乎没有。培养20天后,生长点前端较小的薄片有可能死亡,所切的薄片越小死亡率越高,从生长点端开始每切一刀分别标记,最后统计其死亡率。

由表3可见,外植体第一刀剪切的块太小,由于自身营养不足,又不能从培养基中吸收营养,死亡率很高,随着第二刀、第三刀剪切块的增大死亡率逐渐减小。

b.愈伤组织诱导及分化培养接种于外植体培养基上的薄片,大约经过30天开始膨胀、产生愈伤组织,愈伤组织诱导率达80%以上。将诱导出的愈伤组织转接到MS+6-BAl.5mg/L+ KT0.1mg/L+NAA0.Img/L的培养基上,再经30天左右的培养,即可从愈伤组织上分化出不定芽,形成无根苗。培养条件与外植体建立时的培养条件相同。

c.诱导小鳞茎产生 将已分化出的无根小苗,剪去上部叶片,转接到高蔗糖的MS培养基加适量多效唑和适量的6-BA、NAA培养基上,经过1个月的培养小苗分化成小鳞茎。培养温度28-30℃,光照2000lx。

d.小鳞茎长大培养 将已分化出的小鳞茎转接到相同的培养基上继代培养,使小鳞茎长大。若小鳞茎上有叶片长出,应将其切除。在此培养基上培养1个月左右,即可将小鳞茎上的鳞片剥下,重新接入分化小鳞茎的培养基中,重复c和d两个过程实现扩繁。小鳞茎长大的培养温度为28~30℃,光照为2000lx。

Tanimoto等研究多胺显著促进麝香百合小鳞茎的形成,其中



效果最好的是精胺。Lim等研究,在16h光照、30g/L蔗糖的条件下,1/2MS促进百合小鳞茎的数量增加;在连续黑暗条件、90g/L蔗糖的条件下,1/4MS则鳞茎生长最大。

e.病毒检测

酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测试剂:美国Agdia公司生产的植物病毒酶联试剂。检测结果通过观察颜色和酶联仪测定OD值判断。阳性对照为淡黄色;阴性对照无色。脱除黄瓜花叶病毒(CMV)、百合无症病毒(LSV)、郁金香碎花病毒(TBV)、百合斑驳病毒(LMoV)、百合X病毒(LVX)、百合丛簇病毒(LRV)等主要病毒,脱毒率达90%。这种方法有其优缺点,在实际应用上有的方法提纯过程繁琐、费时,有的操作繁琐,易造成污染,出现假阳性。

DNA芯片技术检测法该方法是根据百合病毒病的3种病原CMV、LSV、LMoV的核苷酸序列,结合计算机软件分析及NCBI-BLAST分析,设计并筛选出3对特异性引物和6条特异性探针,发展了一种以荧光标记不对称PCR为基础的基因芯片检测方法,具有较高的敏感性,能够检测102-3拷贝的质粒,相当于10-4—10-3的DNA。田间百合样本运用该基因芯片技术体系可以同步检测百合病毒病的三种病原体,实现了芯片在植物病毒中多种病原体的同时检测。这是本方法的突出优点,为出入境检验检疫及大规模筛查探索了一种很有效的、非常有前景的方法。

目前,检测百合病毒的方法还有电镜技术和RT-PCR技术。

f.瓶球驯化及种植瓶球出瓶前,将瓶口打开晾3天,再用镊子轻轻取出瓶球,洗净苗基部黏附的培养基,然后埋入消过毒的蛭石或草炭塑料箱中。保持温度22℃士20℃,介质湿度50%~60%,3~4天后使温度和湿度逐渐下降,温度由22℃降到10℃,湿度降至48%。经过15天驯化,再移到3~5℃冷库中处理3~4周后入温室栽培。也可以带瓶过渡和处理,最后消毒种植。

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